一、基本原理

酶联免疫（ELISA）是免疫酶技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术。

ELISA的技术原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，形成稳定的酶标抗体（或抗原）结合物，当酶标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，使用ELISA检测仪，即酶标仪，测定其吸收值可做出定量分析。此技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用。本试剂盒工作原理如下图所示。

二、已配试剂

ELISA试剂盒中配备以下条目：

1、96孔已包被好的酶标板

2、标准1：0.1 ng/mL的MC-LR标准溶液

3、标准2：0.2 ng/mL的MC-LR标准溶液

4、标准3：0.5 ng/mL的MC-LR标准溶液

5、标准4：1 ng/mL的MC-LR标准溶液

6、标准5：2 ng/mL的MC-LR标准溶液

7、1瓶溶液1 （单抗）

8、1只溶液2 (此溶液仅为二抗稀释所用，并非二抗溶液，请按稀释比例量取！)

9、二抗（小管内含2.4 μL酶标二抗，4℃保存）。

10、1瓶溶液3（底物溶液）

11、1瓶溶液4 （终止液）

12、1袋固体PBS（配置洗涤液用）

13、1只Tween 20 （配置洗涤液用）

三、操作步骤

1、分别吸取50 μL毒素标准品或样品与对应的孔中（参照表1），然后吸取50 μL单克隆抗体（溶液1）加入每孔中，轻轻混匀。37oC或室温放置90分钟。注意：必须先加标准品或样品，再加单克隆抗体溶液。

2、洗板

在水池边快速甩出酶标板中的液体。用吸管吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。甩出洗涤液，再加洗涤液，重复上述操作三次，每次操作3分钟。在滤纸上拍干。若有洗板机，可直接在洗板机上操作。

注意：切忌溢出互混！

3、每孔加入100 μL酶标二抗稀释液，37oC或室温放置30分钟。

4、洗板

同2方法，此步骤必须洗涤五次，每次3分钟。

5、加底物溶液3

立即用排枪或吸管吸取此种溶液，分别加于板孔中，每孔100 μL，置37oC或室温显色，经常观察，显色时间不超过30分钟。

6、终止反应

有明显颜色显示后，立即加50 μL 溶液4 1 mol/L H2SO4终止反应。

7、判断结果

肉眼观察（白色背景），阴性对照孔应明显黄色。

测光密度，酶标仪取λ=450 nm。注意：加终止液后，30分钟以内检测。

注意：滴加试剂量要准，且试剂不可从一孔流到另一孔中，每种试剂对应一种吸管（或枪头），不能混淆。