心脏组织单细胞解离酶MJ001专为人、小鼠、大鼠等动物心脏组织单细胞悬液制备设计，通过多元复合酶的温和酶解作用将心脏组织高效解离成为单个细胞悬液，在高得率的同时能够获得高活性的单细胞，后续适用于单细胞测序、流式细胞分析、流式细胞分选、原代细胞培养、类器官3D培养等实验。

1、溶解酶干粉

初次启用试剂盒时执行该操作步骤。将A瓶中的酶干粉用力甩至瓶底；然后用移液枪取B瓶中的溶解液反复吹打A瓶中的酶干粉并转移至B瓶中，必要时可将枪头口用剪刀剪大，确保A瓶中酶干粉全部转移至B瓶中；随后盖紧B瓶瓶盖上下颠倒B瓶直至酶干粉完全溶解，必要时可放置摇床上摇晃至完全溶解，完全溶解的酶溶液呈现清澈微棕色。

2、过滤分装解离酶

在A瓶中酶干粉完全溶解在B瓶溶解液后，根据后续实验如需要无菌解离组织，则需用注射器和0.22μm无菌过滤器过滤除菌后分装。建议每5mL分装一瓶，分装至A瓶中，分装后应立即冻存在-20℃或-80℃冰箱中，可保存6个月。单次未使用完可冻存后下次继续使用，但反复冻融不要超过三次，每冻融一次酶活会降低一部分，酶活降低时可增加酶的使用量以增强酶解效果。

3、酶解实验操作

(1)实验准备：预制碎冰，冰上解冻单细胞解离酶和酶解终止液，单细胞解离仪器开机预热，PBS预冷，眼科剪、镊子等无菌手术器械，40 μm无菌细胞筛，离心管、离心机等预冷。

(2)组织收集：无菌条件下收集组织，立即置于冷的PBS中，尽可能4h内处理，如需放置更长时间，请使用高活性组织保存液（货号MJ104）。

(3)清洗组织：将组织用冷PBS洗1-2次以去除血液、坏死组织等杂质，称重记录。

(4)剪碎组织：将清洗过的组织转移至解离管中，用锋利眼科剪碎成1-2 mm³小块，剪至泥糊状，剪得越碎酶解就越充分，单细胞酶解时间就会越短；如有配备组织单细胞解离仪，觉得剪碎较麻烦也可不用严格剪碎，同样能获得较好的解离效果。

(5)酶解组织：组织剪碎后，取适量单细胞解离酶加入解离管中，上下颠倒解离管使解离酶与组织充分混匀。

①如配备有组织单细胞解离仪，可按照仪器操作规范进行单细胞解离。本产品适用市面上所有进口或国产品牌的组织单细胞解离仪，但需注意本产品解离效率比自备酶或其他竞品的酶都高，解离时间可减少至少一半，需每隔5-10min确认一下解离情况，不同组织解离完全的时间从5min到50min不等，在保证解离效果情况下尽可能减少酶解时间，酶解完全即可终止酶解；

②如未配备组织单细胞解离仪，也可进行手动解离。在剪碎组织步骤中需严格按照要求剪碎组织；根据组织和所加酶体积选择在1.5mL EP管或5mL EP管中，将解离酶与组织充分混匀，用剪刀将1mL移液枪枪头口稍微剪大后，用移液枪用力吹打混合物，如吹打堵塞枪头说明组织剪碎不够彻底，可继续剪碎组织或将枪头再剪大一些，保证能用移液枪反复吹打混合物，反复吹打十余次后立即放入37℃培养箱、水浴或金属浴中孵育，有摇床效果更佳，每孵育5分钟需进行一次反复吹打，直至组织团块完全解离成单细胞悬液。

(6)单细胞过滤：待组织完全解离后，立即瞬离解离管3s，并将解离管插在冰上，用移液枪吸取上清通过40 μm的滤网进行过滤，过滤全程在冰上操作。

(7)终止酶解：取等量的酶解终止液（货号MJ102）或完全培养基进行终止酶解。

(8)收集细胞：4℃、400g离心5分钟后弃上清，用预冷的PBS清洗后再离心弃上清。

(9)红细胞裂解：取适量红细胞裂解液（货号MJ103）重悬细胞沉淀，冰上孵育10分钟，间歇吹打轻摇，4℃、300g离心5分钟后弃上清。

(10)清洗：取预冷的PBS重悬，4℃、300g离心5分钟后弃上清，重复清洗2次

(11)去除碎片：如碎片较多，可用高效碎片去除剂（货号MJ101）去除碎片。

(12)细胞活性检测：台盼蓝或AOPI染色，活细胞率应＞85%。

(13)细胞冻存：如单细胞解离后暂时无法进行后续实验，可使用高效高活细胞冻存液（货号MJ105）将单细胞重悬后直接冻存于-80℃，可冻存数年。

实验注意事项：

本产品单供科研使用；如下游实验需无菌培养，全程需在超净台内进行无菌操作，避免污染；酶解需在37℃，其他操作均在冰上操作，严格控制温度；根据组织酶解量调整酶解时间，勤观察及时确认裂解阶段，在保证裂解效果情况下尽可能减少酶解时间，以免时间过长造成对细胞的损伤；若用于单细胞测序等要求较高的单细胞制备，全程需加快速度，单细胞解离后需立即进入下游建库步骤；该酶溶解后-20℃或-80℃保存，可保存6个月，单次未使用完可冻存后下次继续使用，但反复冻融不要超过三次，每冻融一次酶活会降低一部分，酶活降低时可增加酶的使用量以增强酶解效果。