什么是自发荧光？自发荧光 (Autofluorescence, AF) 是指细胞内因存在的某些荧光成分和代谢产物在受到特定波长光激发时产生的固有荧光。常见的内源性荧光物质，如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 、氧化型黄素辅酶 (FMN/FAD) 、维生素以及含有芳香族氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的蛋白质。

自发荧光（AF）干扰给流式细胞术的检测带来巨大的困扰，使荧光信号的检测、定量和解释更加复杂。同时，异质性的自发荧光在不同细胞类型和成分之间变化，使结果分析复杂性增加。

流式细胞术中AF的挑战

虽然AF有助于评估细胞状态，但其光谱干扰（尤其在400-600 nm区间）会掩盖弱信号标记物（如FITC/Alexa Fluor 488），导致：

• 信号分辨率下降：巨噬细胞、死细胞等高AF细胞影响显著；

• 动态波动干扰：细胞大小、代谢状态、固定方法均会改变AF强度；

• 影响细胞类型结果特异性：髓系细胞（富含荧光颗粒）、抗原呈递细胞（高线粒体含量）AF本底高。

图1：细胞自发荧光差异示例

A. 植物细胞流式分析：由于不同细胞成分和色素导致的各个通道的AF差异，特别是叶绿素导致特定通道高AF（数据来源：都柏林大学学院（UCD）流式细胞技术核心主任Alfonso Blanco博士分享）

如图1所示，在未染色的植物提取物中检测到升高的自发荧光（AF）水平，提示后续实验分析可能存在潜在的复杂性。实验程序和染色技术，如醛固定和营养物质的供应，也会影响细胞的自发荧光水平，从而增加细胞分析中自发荧光的复杂性和变异性。

传统的流式细胞术无法有效区分AF，业内的研究都把希望寄托在光谱流式细胞术，但此前的光谱流式细胞术也面临诸多难题。

光谱流式细胞术中的AF难题

光谱流式细胞术通过捕捉每种荧光分子在广泛波长范围内的整个发射光谱，为其生成唯一的光谱特征，随后用于特定光谱解混和识别。然而，光谱流式通过全光谱捕获实现多色解混，但AF仍带来三大挑战（图2）：

• 异质性AF干扰：不同细胞类型的AF光谱特征各异；

• 弱信号掩蔽：高AF背景淹没低表达靶标信号；

• 光谱重叠：AF与荧光标记发射谱重叠导致假阳性。

图2：AF在光谱流式中的典型干扰

A. 不同细胞的异质性AF信号；B. 高AF导致弱信号群体难识别；C. AF与目标荧光光谱重叠

如何应对这些挑战和难题，需要全面了解样本、精心设计实验、严格的去混合技术以及适当的对照，以提高数据的准确性和可靠性。同时，使用多个通道区分自发荧光信号和特定的荧光染料至关重要，因此我们需要一台功能更全面的科研利器的助力。

贝克曼库尔特生命科学近期上市的👉CytoFLEX mosaic光谱流式分析仪可提供10个未染色通道，可从中提取不同群体的自发荧光特征，提升弱信号的检测能力，帮助发现低丰度亚群。

下图显示了在CytoFLEX mosaic光谱流式分析仪上评估了AF提取对白细胞群体谱解混的影响，并评估了使用多个AF特征是否进一步改善了解混。

针对不同细胞群体（中性粒细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）表面标志物表达的直方图，在同一文件中考虑了0、1、2或4个自发荧光签名在解混矩阵中的影响。红色（No AF）表示没有进行自发荧光提取的数据，蓝色（1 AF）表示去除一个自发荧光签名后的数据，橙色（2 AF）表示去除两个自发荧光签名后的数据，绿色（4 AF）表示去除四个自发荧光签名后的数据。结果显示，通过优化AF校正，减少了嗜酸细胞、单核细胞和淋巴细胞中假阳性CD16的情况，同时保留了真实的生物信号。

超越噪音：光谱流式细胞术

中自发荧光管理的策略

光谱流式方案

1对于简单样本：未染色的自发荧光细胞有独特光谱指纹，可将其作内源性染料，设计检测方案，计算去除自发荧光，能准确分析特定标记荧光，对识别低丰度标记、描绘其表达和亚群分布及提高阳性群体分辨率关键。

2对于异质性AF样本：建立多类型AF光谱数据库；采用多元未染色对照捕获AF变异，建议使用多样的未染色对照，能够有效地考虑不同细胞类型所展现的自发荧光强度的固有变异性。👉CytoFLEX mosaic光谱流式分析仪可提供多达10个未染色通道，可帮助异质性样本建立更多元的光谱模型。

3靶标结合光谱变异：对像串联聚合物染料这样的荧光素，通过基于微球或细胞对照验证实现最佳解析结果，排除自发荧光信号影响。

4通过门控分群、降维聚类等方法提升AF解析精度：先进的光谱去混合算法和适当的补偿对照可以更好地将真实信号与噪声隔离，从而显著提高流式细胞术实验的精度和可靠性。CytoFLEX mosaic👉提供泊松混合 (Poisson hybrid) 算法，凭借更符合实际的统计模型、更精准的信号控制能力，以及更高的抗干扰能力，能够有效地提高光谱流式细胞术的分析精度和数据质量。

CytoFLEX mosaic还提供了光谱拆分后的结果验证功能，实时评估解析准确性。当数据出现异常时，仪器能自动提示潜在问题通道，让研究人员轻松快速地排除数据隐患，保障实验结果的可靠性。最后，光谱分析软件CytExpert for Spectral，延续了CytExpert软件智能易操作的特点，非常容易学习和操作。