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库尔特原理诞生与发展的历程--纪念库尔特原理发明50周年


来源:贝克曼库尔特公司

标签库尔特
库尔特原理发明50周年

    自从20世纪50年代中期发明库尔特原理后,库尔特原理成为了行业的根基,响应了对自动化血细胞计数仪器的需求。华莱士•H. 库尔特和他的兄弟小约瑟夫•R. 库尔特提出了一种使细胞通过一个感测小孔的简单想法以来,此行业的发展经历了三个阶段。在第一个阶段,华莱士希望将常规的红血球计数工作变为自动操作的愿望,促成了上述简单想法的提出、库尔特原理的定义、此原理的专利获得、其被美国国立卫生研究院认可、以及在一次美国国家级研讨会上对此原理进行了阐述。在第二个阶段,库尔特兄弟专注于商业化仪器的实用化,并专注于通过经营公司来支持此仪器的生产和销售。在第三个阶段,针对感测孔功能特性引发的体积测定错误,进行了广泛的研究;库尔特兄弟不断成长的公司找到了各种解决方案,从而开发了自动化越来越高的血液分析仪。目前此行业非常兴旺,有好几个公司参与其中。

简介

    “一个孔不可能获得专利权”。几个律师都持这种看法,拒绝受理华莱士•H. 库尔特希望将红血球计数的自动化方法申请专利的请求。1  对于每一份试样,一名技术人员要花枯燥的30来分钟,通过显微镜来计算标准容器中红血球的数量,获得的结果很少可复验。自从华莱士(图1)读了Moldavan在1934年写的笔记(其中建议在含有细胞的悬浮液流过一根安装在显微镜处的毛细管时,采用光电方法对细胞进行计数)后,他非常希望能将这种计数工作自动化。10多年过去了,华莱士发现了一种更好的方法,而当他准备宣布此方法时,又一个10年过去了。

第一阶段

    通过在其它地方获得了技术经验后,华莱士于1946年回到了芝加哥,此后他邀请了其兄弟小约瑟夫•R. 库尔特(图2)加入他的研究。他后来回忆了他们在一个地下室实验室中的工作:3 “最开始的方法是对向下经过毛细管、通过一条光束的血细胞计数,就像统计正走下走廊的人们的人数一样。但我们没有获得非常好的感测信号,我们问自己这是为什么。除了调节光束的方法外,是否有其它方法由细胞的通过动作产生电脉冲信号?”尽管当时我们不知道答案,但血细胞是绝缘体 – 因此我们通过调节电流而不是调节光束,而获得了解决方案。

    通过一项本质上简单的解决方案,华莱士在1947年已经将毛细管的长度降到了最低。1“在我们开始时,我们没有多少钱,我们在烟盒上取下的一张玻璃纸上,用加热的针刺了一个小孔。虽然这种小孔维持不了多久,但我们对一些细胞进行了计数。”刺有小孔的玻璃纸通过橡胶圈固定而覆盖在玻璃管的末端之上,并将连接在电源上的两个电极分开,悬浮在离子介质中的细胞和电流仪器流过刺有小孔的玻璃纸。一个细胞在此小孔中的液体排水量(等于其自身体积),与传导电流流经此小孔的两个电极之间的电压脉冲成正比。





    库尔特兄弟发现,细胞和悬浮介质之间的电反差,是通过光电方法获得的反差的10倍,通过所产生的电压脉冲可非常容易地对流经小孔的悬浮液中的细胞进行准确计数。这项发现促使华莱士不惜花了非常长的时间来寻找一位愿意代办专利权申请的律师。最后在1948年,有人介绍了Irving Silverman给他,后者认可了此项具有重大潜力的新方法。1949年,提交了专利权申请。

    但专利权审查人员也怀疑是否可对一个孔能授予专利。幸运的是,他猜想如果可以提供一些应用例子(而不仅仅提供“通过小孔的轴向电流和感测通道”这一原理),在对狭小电流通道中的粒子进行感测的原则基础上,可以获得专利。1 对横穿小孔中悬浮液流的模拟通道进行了描述,还描述了具有非圆形横截面的小孔。一根绝缘的针搜寻稳定悬浮液中经过的粒子是另外一个例子;一个粒子的存在,是通过移动的针和接触导电悬浮介质的另一个电极之间电流中的脉冲来感测的。因此这样定义了新的库尔特原理,在50年前的1953年10月20日,授予了具有开创性的专利权,在试管的内壁较低处形成的极微小孔为专利首先的实例。

    同时,库尔特兄弟继续进行研发,重点在于使自动化变得可行。在Walte Hogg(约瑟夫在服役时的朋友)的无偿帮助下,库尔特兄弟组装了一台实验性仪器(与海军研究局签订的合同项目):一个机械测量系统驱动受控制的一定量的细胞悬浮液流过小孔,同时一个连接器件向其提供电流,并通过具有可调阀值的电压放大器感测所产生的信号脉冲。超过阀值的信号脉冲会触发安装在连接器件顶部的一个脉冲计数器(Berkeley科学模型410;贝克曼仪器公司,[当时]在加州里士满)。通过连续增加阀值,对样本重复进行测试,可人工记录细胞大小的累积分布。由于需要监测小孔是否部分阻塞,因此加装了一台示波镜,可以同时监测信号脉冲和阀值的设定。

    经验同样告诉我们,需要对通过小孔后悬浮的细胞数量进行精确测量。库尔特兄弟发明了一种很好的建立水银压力计基础上的方法(见图3)。约瑟夫一次这样说道:“正是压力计使得计数器工作。它很简单、很容易控制、而且它能够一直工作。”这一测量系统加上一台对准着小孔的显微镜一起构成一个样品台的基础,它可以30年基本保持不变。1952年,制作了包含新的样品台的最早的两架仪器;连接电子器件和示波器被集成到一个合成的控制台上,其中还包括十进制计数器来累计电压脉冲。1953年,这些仪器原型被送到美国国立卫生研究院进行评估;1956年5月,对压力计测量系统提出了专利申请。6



图3  计数器样品台的功能示意图 ,由库尔特兄弟共同发明。6  当管闩F打开时,压力计储液槽R中的水银被连接至P的小型真空泵抽吸,所产生的压力差会在管闩F关闭后使得水银柱J移动,使样品悬浮液E通过带孔圆片A从样品槽流入样品管B中。带孔圆片和样品管有介电材料制成,其电阻率比悬浮介质的电阻率要大得多。通过连接线H和I,电极C和D通过小孔将电流连接起来,且将所产生的信号脉冲送至放大器和脉冲计数器(没有显示)。需要分析的样品的体积由三个控制电极(K, L, M)测定,这三个电极穿过了压力计管的管壁;当流动的水银造成K和L之间有电接触时,脉冲计数器启动,而当水银与M接触时会使计数器停止工作(M与L之间的距离经过了校准)。只有当悬浮液以恒速流过小孔时才会对细胞进行计数,这样使得可测定细胞的浓度,因为悬浮液体积等于电极L和M之间的水银的体积。第二个管闩G只在下列情况下打开,即用清洁的悬浮介质通过O来填充或冲洗样品管时。观察小孔的显微镜没有显示。以上内容根据华莱士的论文改写。


    1956年华莱士其个人技术论文中正式宣布了库尔特原理。7  “在新的计数器中,让单个细胞穿过悬浮液中一个小的狭窄电流通路,然后检测细胞和悬浮液各自导电性的差别。一个小的狭窄电流通路和光学系统中的一小束光线类似。在通过液体中小的电流路径时,单个血细胞改变了电路中的电阻,使得穿过电流通路后电压的下降发生了变化。小规模的电流通路和流过通路的含有细胞的液体流都具有简单的结构。电流通路的边界就是一个绝缘容器内壁上尺寸很小的潜孔口。” 在图3中,该潜孔口即是带孔圆片A上中心孔。

    此后不久,出版了两份美国国立卫生研究院的评估报告。8,9 两份报告都认为库尔特方法在给红细胞计数时提高了准确性、有效性和方便性。刊出其中一份评估报告的期刊同时也做了新的库尔特计数器®的第一份广告。另一份评估报告9 认为粒度分布上的偏斜度是细胞重合造成的,并提供了一种纠正重合造成的计数损失的人工方法。它还包含了白细胞计数的初步数据。

    自动进行重要血液测试工作的可行性已经得到证明,但商业化运作还未展开。牢固地固定小孔的工作还很困难。10  压力计(用来测量通过小孔后悬浮物)中使用的水银也是需要顾虑的事情,实验性计数器中的机械系统就显得尤为重要 。用来为小孔提供激励电流的电压源对小孔以及用来悬浮细胞的介质的特征,都会产生无法接受的灵敏度。在美国国立卫生研究院开展的研究中,已经确认需要自动稀释计来精确地稀释样品。13 约瑟夫后来总结这十年来的准备工作时说,“我们知道还有很多问题,但是我们已经知道了一些有用的东西。”下一个十年就要开始了,很快在新申请的专利中都会有这些问题的解决方法。

第二阶段

    库尔特计数器的核心是感测小孔(见图3,圆片A上的小孔),它这时得到了库尔特兄弟最多的关注。对于许多潜在的应用来说,要求小孔直径小于100 lm,允许的尺寸和形状容差都很小。样品试管壁上直接做成的小孔可重复性低,这样就促使对玻璃带孔圆片(形成毛细管的横截面)进行实验。但是用来固定圆片的接合剂没有成功(无效),且如果将下孔焊接在样品试管上,热量会使得小孔扭曲变形。还试用了用作表轴承的环宝石,Hermann Foery(瑞士珠宝公司,位于瑞士洛迦诺市)提供了实验用的宝石,用其做成了早期低噪声小孔。与Sam Gutilla(美国伊利诺斯州芝加哥市Del Mar Scientific公司)合作,开发出一种将宝石焊接到样品试管上的方法。宝石上精确的柱状小孔不受焊接的影响,并为电流的流动和样品悬浮液提供了持久耐用的管道。

    到1958年底,对焊接有环宝石的可互换样品试管(见图3中的B)的提出了专利申请。10 所选宝石的厚度可以提供小孔长度直径比约为0.75,这样可以尽量减少基本专利4和美国国立卫生研究院研究9中提到的微粒重合现象。到了1958年,库尔特兄弟已经准备好创立库尔特电子公司,以及库尔特销售公司。母公司最早的两名全职员工是长期提供义务服务的小约瑟夫 R.库尔特和沃尔特•豪格(Walter Hogg)。库尔特兄弟的父亲最初只是周末到公司来做兼职的秘书和会计工作,但此时他已经68岁了,他从铁路报务员的岗位上退休,和他的儿子们一起工作,一直到1971年才部分退休。沃尔特是第一个在公司工作达20年之久的员工,指定其为发明人的美国专利比指定华莱士为发明人的美国专利还多一些(各为95项专利和82项专利),沃尔特也是公司内唯一比华莱士拥有更多专利的员工。

    事后看来,1958年是一个重要的起点。Kilby发明了振荡器——第一个集成电路。很快地,Noyce和Hoerni开发出平面工艺,使得微电子迅猛发展。Townes和Schawlow描述了微波激射器在光学频率上工作的要求,在两年后,Maiman发现了激光。所有这些发展都为新公司的未来起到了举足轻重的作用。

    开始时由Ernie Yasaka组装原型的复制品14,也就是现在所说的A型库尔特计数器®,由华莱士进行销售。为了可用于工业目的15 ,在样品台上添加了一个搅拌器(见图4)。新公司立即需要关注的是一篇论文证实脉冲幅度和颗粒体积之间有正相关关系。通过将一个库尔特计数器®和具有双可变脉冲阈值的单通道脉冲-高度分析器(PHA)进行连接,Kubitschek获得了第一个微分粒度分布;这样就凸显出A型计数器的两个缺点:第一,它单一的阈值需要通过连续增加阈值进行多次样品测试来获得累积粒度分布14,16,而且需要大量的时间和计算来人工获得微分粒度分布。很明显,非常需要自动化方法进行粒度分析;第二个缺点是,用于提供小孔电流的电压源使得脉冲幅度对于特定小孔的大小、特定悬浮介质的电阻系数以及特定悬浮介质中温度引起的变化都很敏感14,15,这些都使精确计数和粒度分析变得复杂。



图4 A型库尔特计数器,带工业用途样品台(图3),右边所示。样品台右上侧的黑色圆形物体为搅拌器马达,用于使工业用途粒子保持在悬浮液中;在血细胞计数时,样品架上不会使用搅拌器。控制台从左到右包括:机械计数器(用于慢速累计的高值数字),三个十进制计数器(用于快速累计的低值数字),以及示波镜显示管。单阀值和小孔电流的控制装置在显示管治下。


    在白细胞计数上取得了良好的成果后17,公司在1960年引进了一种改进的仪器18 ,旨在进一步对细胞和颗粒大小进行精确的测量。使用电流源对小孔进行激励代替了原来的电压源,而用来感测颗粒脉冲的双阈值电流灵敏放大器代替了原来的单阈值电压放大器。因此,B型库尔特计数器对限制A型计数器的那些因素不敏感,它的双阈值联锁,形成了一种可移动的通道,由定序四秒计时器来控制。它附属的H型分布绘图仪20可以从100秒样品运行中自动累计25个通道的微分粒度分布18。C型库尔特计数器的开发也取得了进展——它的原型包括12通道的脉冲-高度分析器。它的350多个真空管可以给公司的设施供暖,它的体形巨大,搬运时需要拆开。到1961年,当公司从芝加哥搬到佛罗里达州的Hialeah时,C型库尔特计数器已经小到可以放在桌面上了。

    20世纪60年代,在红细胞和白细胞7,18,22–28的计数和大小测量上,A型和B型计数器都证明很有用(见评论25,27),而且在微生物学和工业领域粒度分析上也获得了应用31 。但同时,也产生了担忧。1959年,按照库尔特原则设计了一种商用型仪器。32  1960年,美国国立卫生研究院研究中9所发现的非对称分布得到了证实。笨重的稀释器促使一位客户自己设计更好用的仪器22。1962年,发现感测小孔的长度直径比影响粒度分析的分辨率。34 一家公司(后来成为库尔特兄弟公司的竞争对手)就库尔特原则的一种衍生模式35申请了专利,而库尔特销售公司的一名主管自己也申请了一种衍生样品管的专利36,他后来离开了库尔特公司,也成为了库尔特公司的竞争对手37。此外,早期的血小板计数实验也遇到了没有预想到的干扰,干扰显然来自相位显微镜无法发现的小颗粒38。

    Lushbaugh等人将100通道的PHA和A型库尔特计数器39,40连接在一起,提高了测量的成本。很快,几家公司都把为特定目的制作的库尔特颗粒感测器和商用型PHA连接在一起,可以提供多达512个通道29。体积测量工具的可用性和复杂度越来越高,使得在测量各种细胞和颗粒的粒度分布上,使用人工工具越来越明显1。华莱士这样评论说,“面临挑战也很好,我们肯定能够分享一部分好处。”

第三阶段

    感测小孔(见图3带孔圆片上的小孔)是库尔特原理的核心,设计一个库尔特计数器,自动弥补其功能特点上的不足,现在成为首要任务。美国国立卫生研究院的研究注意到,感测小孔的敏感量是几何小孔的三倍,这是激励电流流过样品容器和样品管中悬浮介质所产生的电场的结果(见图3)。量测系统产生的类似水动力场使得细胞(或粒子)通过感测小孔时,细胞(或颗粒)和电场产生相互作用。对于两种小孔场来说,重要的颗粒相互作用是发生在包含感测小孔的敏感体积内,而且从小孔入口和出口处成半椭圆形向外延伸到三到四倍小孔直径的距离处。

    因此,通过排出和细胞相同体积量的导电悬浮媒介,每个细胞在它的范围内扭曲了电场——特别是在通过感测小孔时。结果是,细胞的体积和小孔的相当。小孔电阻的变化(通常是50,000分之一),以及通过小孔时带来的电阻的细小变化,产生了信号脉冲,这样就能够进行细胞计数和测量大小。要达到精确的计数和可重复的大小量测,要求通过小孔的悬浮流非常平稳。

    和离子电流不同,由于悬浮介质的聚集和黏性,悬浮液流受到感测小孔表面惯性和边界层的影响。结果是,这些对小孔和它的两个孔口产生微几何学反应50 ,在小孔轴心中点周围产生不对称的动力流场。在出口孔洞产生的环型流体将颗粒带回小孔的感测体积内,这样会产生二次脉冲,导致错误的颗粒计数结果。例如,沃尔特•豪格在一次早期的血小板研究中发现38,所遇见的假微粒是那些重新进入感测体积内的红细胞,二次脉冲使它们重新被计作血小板。将颗粒从出口孔带走的辅助流可以防止颗粒循环和二次脉冲。

    一直认为同时通过小孔敏感体积的细胞通过屏蔽颗粒脉冲会减少细胞计数4,7,但计数上的损失可以通过悬浮液中细胞浓度从统计学角度预测出来9,52–60。因此,单通道计数可以通过合适的电路自动纠正61,最新一个版本的D型库尔特计数器介绍了这一方法。然而,同时通过的颗粒产生的非典型脉冲还导致了粒度分布变宽45,典型红细胞粒度分布出现不对称39–41,44,62。在美国国立卫生研究院的研究中9把这种不对称归为粒子重合,但很快在其它细胞类型38和粒子的粒度分布中也发现了这种不对称31,63,64。在提高测定体积的准确性后,红细胞的粒度分布被证实呈双峰性40,41,65。这些分布假象都造成尺寸测量的分辨率降低。

    到20世纪60年代后期,与体积测定产生假象的原因有关的研究迅速发展28,30,44,45,49,65–78,几个研究单位根据库尔特原理建立起实验系统。颗粒以离轴不同的径向距离通过感测小孔时,会出现麻烦的粒度分布假象。在低有效颗粒浓度下,长度是直径几倍的小孔可以提高测量分辨率34,41,67,80,围绕一个更小悬浮液流的辅助流可以水动力方式将通过小孔的颗粒集中在轴附近。在典型的颗粒浓度下,在小孔中心点对信号脉冲抽样,或者按照持续时间对信号脉冲进行选择,可以大大提高体积测定的精确度(见概览65,67,78,86–88)。
对小孔功能特性进行研究的一个重要结果就是发明了第一个细胞分类器48,70,89–91,它可以判断红细胞双峰分布是事实还是假象。Fulwyler将库尔特原理和喷墨技术相结合,并使用该成果将细胞从单一的分布模式中挑选出来。当挑选出来的红细胞被重新测定大小后,结果表明原来的双峰形式是一种假象。

    在这次研究大发展中,库尔特计数器的型号随着电子学的发展而发展,装有晶体管的F型和C型同时替代了A型。样品台进行了改装,J型分布绘图仪代替了H型分布绘图仪。1968年下半年,出现了第一个自动化的血液分析计94——7个参数的S型库尔特计数器®。同时,装有晶体管的T型库尔特计数器®代替了C型库尔特计数器®,用于工业目的。在集成电路的基础上,1970年推出了Z系列计数器。1972年出现了Channelyzer®体积分析仪,同时还出现了工业用TA系列分析仪,它包含了计数器和16通道PHA电路。随后不久,这些仪器都开始采用微处理器。

    华莱士经常评论说1,“只要它是有用的,人们就会购买。”随着产品的不断改进,销售量也越来越大。

   2000年以后出品的Multisizer系列在工业、生物等各领域具有不可替代的地位,源自于该型号具备极高的分辨率,并可依据其最新开发的DPP处理器,单独分析个体颗粒的脉冲信号,使得对测量全过程颗粒或细胞的体积或粒径的变化的监控成为可能。该脉冲处理器的技术的诞生也使得粒度分析仪领域添加了一项独一无二的过程监控功能(图五)。




概要

    开始是个不能获得专利的小孔,却促成了一个原理的发现,且获得了专利。库尔特原理的发现来自华莱士将辛苦的例行工作变为自动化操作的愿望,库尔特原理提供了一种可重复的对细胞或颗粒体积(恰当校准时)进行物理测量的方法,此原理还促进发明了一系列越来越复杂的自动化工具。使用库尔特原理的仪器被广泛接受,这使得其它一些公司也纷纷开发出类似的工具。库尔特原理仍然是测量显微颗粒体积的方法之一,已经在许多科学领域被包括在各类标准中。到20世纪80年代后期,仅美国就有5万多种库尔特计数器在使用。描述其实际应用和理论设计的刊物现在数以千计,相关的专利也有好几百种。

    在华莱士的基本专利中,4 他通过两种形式的感测小孔(都是使用介电材料)定义了他的原理。他更喜欢轴向激励/感测这种形式,因为它更容易生产,且产生的是线性体积反应。有趣的是,由于在导电材料上形成的电偶层暴露在离子介质中的电场内,即便是小孔是在导电材料中形成的110,111,上述形式也可以奏效。所产生的信号脉冲除了能反映颗粒的体积,也能反映颗粒的电气化学性质、包含感测小孔的材料以及悬浮介质。如果感测小孔是以混合结构材料中制成,包括两种传导材料中华莱士原有孔洞,这种轴向形式也同样奏效。由于颗粒要么在小孔出口再循环,要么远离轴而通过孔洞,因此所获粒度分布产生的假象最少。

    库尔特原理的轴向实施模式迄今已经获得了广泛的关注,但是由于热噪声的原因,使得将其尺寸缩小的努力遇到了瓶颈。原则上来说,第二种形式采用横穿悬浮流的激励和感测,这样可以感测到更小的颗粒,但代价是要求体积线性化(基于选定形状的小孔和电极)。35,113–115

    库尔特原理第四阶段的发展是包括以上所说的这些,还是将新出现的科学技术和已有的技术相结合,我们拭目以待。

后记

    当库尔特在努力领悟怎样发现库尔特原理时,他的父亲为兄弟俩写了这样一首诗:

    为什么不去导引它,它在你的掌握之中,你能哺育和引导它,你能达到你的目标!充分利用这一天分,让它朝好的方向努力。你的思想就是你的生命;天才利用它——你也一样!

    这出分为三幕的戏剧(本文的三个阶段)表明他和约瑟夫都很好地领会了父亲的建议。华莱士看不到问题,但他能发现很多机会。他的发明洞察力在科学界得到广泛的认同。约瑟夫能发现问题但是他把这些问题看作是挑战。他在技术和商业领域都是一个执行者。兄弟俩都相信科学应该服务于人,他们俩互补,成功地为当今科学设备的发展作出了贡献。他们的努力所产生的人文价值勿庸置疑。

    尽管他们取得了许多成就,库尔特兄弟(见图6)仍然保持谦虚,并对革新性的思想保持热情。他们对家庭十分投入,这也包括他们的雇员和朋友。两人将自己的时间、经验和知识都无私地与他人分享。两人都十分自立,但在一个难以达到的目标上又相互支持帮助。当他们付出的某次愿望良好的努力难以达到预期目标,而且代价昂贵时,华莱士解释说,“不尝试的人是不会犯错误的”,而约瑟夫补充说,“有些东西是比金钱更重要的。”



    一个人能有一位良师是幸运的。而那些有幸和库尔特兄弟一起工作的人拥有了两位良师。这篇简短的回顾文章是为了纪念杰出的兄弟俩,他们总是喜欢努力做得更好,也鼓励自己做得更好。(编辑整理:陈卫)
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